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DC FieldValueLanguage
dc.contributor.authorProbst, Christopher-
dc.date.accessioned2019-09-02T10:03:49Z-
dc.date.available2017-02-20T12:12:12Z-
dc.date.available2019-09-02T10:03:49Z-
dc.date.issued2016de
dc.descriptionKumulative Dissertationde
dc.description.abstractDie industrielle Biotechnologie spielt eine wichtige Rolle bei der Herstellung von Feinchemikalien, pharmazeutischen Produkten und Biokraftstoffen. Hierzu werden Mikroorganismen verwendet welche nachhaltige Ressourcen, z. B. verschiedene Zucker, in hochwertige Produkte umwandeln. Es hat sich in den vergangen Jahren herausgestellt, dass genetisch identische Populationen sich phänotypisch unterscheiden können. Der Grund für diese Heterogenität ist vielseitig und kann auf kleinste Gradienten in großvolumigen Bioreaktoren und die Stochastizität der Genexpression sowie der Stoffwechselwege zurückgeführt werden. Die Analyse von einzelnen Zellen konzentriert sich auf die Entschlüsselung der Mechanismen welche zu der Heterogenität in Population führen. Hierzu, werden konventionelle Methoden wie die der Durchflusszytometrie und hochauflösenden Mikroskopie bereits seit mehreren Jahren erfolgreich eingesetzt. Diese Methoden bieten trotz dessen nicht die benötige räumliche und zeitliche Auflösung für die Untersuchung der komplexen Prozesse in Zellen. Mikrofluidik ist eine vielversprechende neue Technologie für die Untersuchung von bakteriellen Populationen auf der Ebene von einzelnen Zellen. Diese Technik zeichnet sich insbesondere durch einen geringen Verbrauch von Reagenzien sowie stabile Umweltbedingungen, durch einen schnellen Masse- und Wärmeaustausch, aus. Um ein besseres Verständnis über die komplexen Prozesse der Heterogenität von Bakterien Populationen zu gewinnen, wurden im Laufe dieser Dissertation verschiedene Werkzeuge in mikrofluidischen Systemen integriert. Darunter zählen das immobilisieren und kultivieren von einzelnen Zellen oder kleinen Zellverbänden sowie auch die Probenahme von einzelnen Zellen. Um einzelne Zellen von Bakterien mit einer hohen zeitlichen und räumlichen Auflösung zu untersuchen wurde ein neues mikrofluidisches System entwickelt welches im Abschnitt „Publication I” vorgestellt wird. Das beschriebene System ermöglicht die Immobilisierung einzelner Zellen der Spezies Escherichia coli in Mikrometer großen Auffangstrukturen. Hierdurch kann das Wachstum einer einzelnen Zelle verfolgt werden ohne möglichen Einfluss der durch die Zellteilung entstehenden Nachkommen. Diese werden durch den konstant Strom an Medium entfernt, welcher auch die ursprüngliche Zelle in der Auffangstruktur hält. Die Analyse von kleinen Bakterien Populationen bis über 500 Zellen im Hochdurchsatz, wird im Abschnitt „Publication II“ diskutiert. Hierzu wurden mehre hunderte Wachstumskammern mit einer Höhe von 1 µm in mikrofluidischen Kanälen integriert, welche das Wachstum von Bakterien in eine Ebene zwingt. Der Stofftransport in einzelnen Wachstumskammern basiert ausschließlich auf Diffusion, wodurch etwaige Scherkräfte auf ein Minimum reduziert werden. Hierdurch kann das Wachstum von einzelnen Zellen auf einer hohen Auflösung verfolgt werden. Zusätzlich, mit Unterstützung von automatischer Bildauswertung, wird die Rekonstruierung und Untersuchung der Abstammung der Zellen zueinander im Hochdurchsatz ermöglicht. Um einen genetisch identischen Ausgangspunkt zu garantieren – eine Zelle pro Wachstumskammer – wurde eine neue Methode zur Füllung von Wachstumskammern entwickelt (Abschnitt „Publication III“). Hierzu wurde eine Luftblase in das System gegeben, welche eine Änderung des Flussprofiles erlaubt. Dadurch wird es kurzeitig möglich einen konvektiven Fluss in der Wachstumskammer einzuleiten. Zellen die mit dem konvektiven Fluss eingespült werden bleiben dann unter Umständen in den Wachstumskammern hängen. Nach dem die Luftblase aus dem System ausgetragen wurde, findet der Stofftransport in den Wachstumskammern wieder ausschließlich durch Diffusion statt. In einer ersten Studie wurde das Verfahren sowie die Effizienz der Luftblasen basierten Beladung von Wachstumskammern untersucht. Es konnte weiter festgestellt werden dass dieser Beladungsvorgang keinen Einfluss auf das Wachstum der Zellen nimmt. Trotz der in dieser Arbeit entwickelten Methode zur Hochdurchsatz Kultivierung und Analyse von Bakterien Populationen in mikrofluidischen Wachstumskammern, war es bisher nicht möglich Proben aus einzelnen Wachstumskammern zu nehmen. In Abschnitt „Publication IV“ wird hierzu die Vereinigung von mikrofluidischer Hochdursatz Einzelzellanalyse und optischer Pinzette vorgestellt. Die optische Pinzette verwendet einen stark gebündelten infraroten Laserstrahl um kleinste Objekte sowie Zellen mit ausschließlich der Kraft des Lichtes zu manipulieren. Es konnte gezeigt werden das einzelne Zellen des Spezies Escherichia coli aus und in die Wachstumskammern überführt werden konnten. Die Charakterisierung möglicher negativer Folgen der Bestrahlung mit infrarotem Laserlicht ergab, dass eine kurzzeitig Verwendung der optischen Pinzette von weniger als einer Minute kein Einfluss auf das Wachstum der Zellen nahm. In einem ersten Experiment konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass eine einzelne Zelle von einer Population separiert und aus der Wachstumskammer in eine noch nicht befüllte überführt werden konnte.de
dc.description.abstractIndustrial biotechnology plays an important role in the production of fine chemicals, pharmaceuticals and biofuels. Microorganisms are used to convert sustainable resources, e.g. sugars, into high value products. Yet, it has emerged that clonal populations can differ phenotypically. The cause of this heterogeneity is manifold and has been related to microgradients in large scaled bioreactors and the stochasticity in gene expression as well as metabolic pathways. Single cell analysis focuses on unravelling the underlying mechanisms of population based heterogeneity. Here, conventional methods such as flow cytometry and high resolution time-lapse microscopy have been applied intensively for many years. Yet, these methods do not offer the temporal and spatial resolution needed for the investigation the complex processes in cells. Microfluidics has become a promising new tool for studying bacteria populations at the single cell level with reduced reagents consumption and stable environmental conditions through fast exchange of heat and mass. For achieving a better understanding of the underlying processes in microbial population heterogeneity, new tools were integrated into microfluidic devices, such as cell trapping and cultivation as well as the sampling of single cells. In order to study solely single bacteria cells with a high temporal and spatial resolution, a new microfluidic device was established as described in Publication I, allowing the immobilization of single Escherichia coli cells in micron scaled barrier structures. Hence, cell growth can be monitored without the interference of descending cells, which are constantly removed by the media flow holding the cell inside the trap. High-throughput analysis of small bacterial microcolonies of up to 500 cells was realized as shown in Publication II by integrating hundreds of shallow growth chambers into microfluidic channels, restricting the growth of single cells to a monolayer. Mass-transport inside monolayer growth chambers solely relies on diffusion reducing shear forces to a minimum. Hence, growth of single cells in monolayer growth chambers can be followed at a high-resolution. Furthermore, by using automated image analysis cell lineages can be reconstructed and analyzed in high-throughput manner. A novel loading procedure was developed, to guarantee isogenic (clonal) starting conditions in microfluidic monolayer growth chambers - one bacteria cell per chamber (Publication III). Here, an artificial introduced air bubble is applied to temporally distort the flow profile, leading to convective flow inside the monolayer growth chambers. Subsequently, single cells get stuck inside the shallow chambers. After the air bubble is removed mass-transport inside the growth chambers is solely dominated by diffusion again. In this study, the process of air bubble based cell loading as well as loading efficiency was characterized and optimal growth condition after cell loading could been shown. High-throughput cultivation and analysis of small microbial colonies in monolayer growth chambers not allowed for retrieving single cells of interest for further analysis on or outside the microfluidic device. Publication IV introduced a new concept by integrating high-throughput microfluidic single-cell analysis and optical tweezers for sampling single cells from small microcolonies. Optical tweezers applies a highly focused infrared laser beam in order to trap and manipulate micron sized objects and cells with the force of light only. It was shown that single cells of Escherichia coli could be dragged in and out of shallow growth pockets. Characterization of the possible influences due to infrared laser irradiation were carried out and obtained result showed that short exposure timesen
dc.identifier.urihttps://dspace.ub.uni-siegen.de/handle/ubsi/1082-
dc.identifier.urnurn:nbn:de:hbz:467-10823-
dc.language.isoende
dc.relation.ispartofseriesSchriftenreihe der Arbeitsgruppe des Lehrstuhls für Oberflächen- und Werkstofftechnologie im Institut für Werkstofftechnikde
dc.rights.urihttps://dspace.ub.uni-siegen.de/static/license.txtde
dc.subject.ddc620 Ingenieurwissenschaften und Maschinenbaude
dc.subject.otherEinzelzellanalysede
dc.subject.otherMikrofluidikde
dc.subject.otherIndustrielle Biotechnologiede
dc.subject.otherMikroorganismende
dc.subject.otherBioökonomiede
dc.subject.otherSingle-cell Analysisen
dc.subject.otherMicrofluidicsen
dc.subject.otherIndustrial Biotechnologyen
dc.subject.otherMicroorganismen
dc.subject.otherBioeconomyen
dc.titleMicrofluidic tools for single cell analysisen
dc.typeDoctoral Thesisde
item.fulltextWith Fulltext-
item.seriesid21-
ubsi.date.accepted2016-02-01-
ubsi.publication.affiliationInstitut für Werkstofftechnikde
ubsi.relation.issuenumber12de
ubsi.subject.ghbsWBKde
ubsi.type.versionpublishedVersionde
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