Nanoporous Anodic Aluminum Oxide/Silicon – Polyester Hybrid Systems for the Detection of Bacterial Enzymes

Abstract

Die Entwicklung gezielter Diagnostik- und Therapieansätze zur Behandlung bakterieller Infektionen steht weltweit im Fokus der Forschung, motiviert durch die zunehmende Ausbreitung antibiotikaresistenter Bakterien. Einer der vielversprechenden diagnostischen Ansätze basiert auf der Verwendung Stimuli-responsiver Materialien, sogenannten "intelligenten Materialien". In dieser Dissertation wurde ein Stimuli-responsives biologisch abbaubares Polymer zusammen mit anodisiertem Aluminiumoxid (AAO) und porösen Silizium Rugate Filtern (pSiRF) zur optischen Detektion von Pilz- und Bakterienenzymen verwendet. Zunächst wurden AAO-Nanostrukturen durch verfeinerte Anodisierungsprozesse hergestellt. Die Anodisierungsparameter wurden angepasst, um die Struktur des AAO an die Anforderungen der Sensorik anzupassen. Die hergestellten AAO-Nanomaterialien mit gut geordneten hexagonalen Porenstrukturen wurden weiter mit Phosphorsäure nasschemisch behandelt, um die Porendurchmesser zu vergrößern. Der Durchmesser und die Länge der Poren wurden mittels Feldemissionsrasterelektronenmikroskopie (FESEM) analysiert. Die Daten zeigen, dass die Porosität linear mit der Einwirkzeit der Phosphorsäure zunahm. Die Abhängigkeit der Porenlänge von der Anodisierungszeit war ebenfalls linear. Die Herstellung von porösen Silizium (pSi) Nanostrukturen wurde ebenfalls im Detail untersucht. Der Herstellungsprozess wurde optimiert, um die gewünschten photonischen Strukturen zu erhalten, die die Anforderungen für die Erkennung des Sensorsignals mit bloßem Auge erfüllen. Die elektrochemische Ätzung von pSi wurde in HF/Ethanol-Gemischen durchgeführt und ergab Nanoporen mit Porendurchmessern und Porenlängen, die sich jeweils linear mit den Stromdichten und der Ätzzeit erhöhten. Das optimale Regime für die elektrochemische Ätzung in Flusssäure/Ethanol (1:2 v/v) zur Synthese von pSiRF-Sensoren mit einem hohen Qualitätsfaktor war eine Periodenzeit von 7 Sekunden für 100 Zyklen bei minimalen und maximalen Stromdichten von 15 und 50 mA cm-2. Spin-Coating und Beschichtung aus Lösung wurden verwendet, um die AAO-, planaren Si- und pSiRF-Sensoren mit dem biologisch abbaubaren Polymer Poly(lactid) (PLA) zu modifizieren. Die Modifikation der Sensoren wurde mittels FESEM, energiedispersiver Röntgenspektroskopie (EDX), thermogravimetrischer Analyse (TGA), Ellipsometrie, Kontaktwinkelmessung und reflektometrischer Interferenz-Spektroskopie (RIfS) untersucht. Die enzymatische Zersetzung von PLA in den Sensoren wurde durch das Pilzenzym Proteinase K und von Pseudomonas aeruginosa (PAO1) (P. aeruginosa (PAO1)) sezernierte Proteasen katalysiert. Der Wasserkontaktwinkel wies auf eine Veränderung der Benetzbarkeit nach der enzymatischen Behandlung hin, was mit einer Reduktion der Carbonyl-Banden in den Fourier-Transformations-Infrarotspektren (FTIR) übereinstimmt. Die Rauigkeitsdaten der Rasterkraftmikroskopie (AFM) und die RIFs Daten bestätigten ebenfalls den Abbau der PLA-Filme bzw. des PLA in den Nanoporen. Die optischen RIfS Daten zeigten eine Blauverschiebung der Werte der effektiven optischen Dicke (EOT) und der Wellenlänge nach der Behandlung mit Proteinase K. Schließlich wurden die AAO- und pSiRF-Sensoren in Kulturen des Bakteriums P. aeruginosa (PAO1) und den entsprechenden sterilen Kulturüberständen getestet. Das Ergebnis zeigte, dass die enzymatische Reaktion von PLA im Vergleich zur freien Enzymlösung nachweisbar war. Interessanterweise gab es bemerkenswerte Farbverschiebungen im pSiRF-Sensor, die von grün zu blau übergingen, nachdem der Sensor reiner Proteinase K Lösung oder P. aeruginosa (PAO1)-Kulturen ausgesetzt wurde. Diese Farbänderung konnte mit bloßem Auge nach der Behandlung des Sensors mit dem Enzym, dem Waschen und Trocknen erkannt werden, was darauf hindeutet, dass dieses Prinzip zukünftig verbessert und potenziell genutzt werden könnte, um bakterielle Enzyme klinisch relevanter bakterieller Krankheitserreger visuell und schnell zu erkennen.

The development of targeted diagnostics and therapy approaches aiming at treating bacterial infections are in the focus of research worldwide, driven by the increasing impact of antibiotic-resistant bacteria. One of the diagnostic approaches is based on stimuli-responsive materials, so-called "smart materials". In this Thesis, a stimuli-responsive biodegradable polymer was combined with anodic aluminum oxide (AAO) and porous silicon rugate filters (pSiRF) for the optical detection of fungal and bacterial enzymes. Firstly, AAO nanostructures were produced via refined anodization processes. The anodization parameters were adjusted to tailor the structure of the AAO to the sensing requirements. The fabricated AAO nanomaterials with well-ordered hexagonal pore structures were further treated with phosphoric acid to widen the pores. The pore diameter, length, and porosity were evaluated by field emission scanning electron microscopy (FESEM). The data showed that the porosity increased linearly with widening time. The dependence of the pore length on the anodization time was also studied, showing also a linear tendency. The fabrication of porous silicon (pSi) nanostructures was also studied in detail. The fabrication process was optimized to obtain the desired structures that fulfill the sensing requirements for bare eye detection. The lectrochemical etching of pSi was carried out in HF/ethanol mixtures and afforded nanopores with pore diameters and pore lengths that increased linearly with the current densities and the etching time, respectively. The optimal regime for electrochemical etching to synthesize pSiRF sensors with a high-quality factor was a 7 sec period time for 100 cycles at minimum and maximum current densities of 15 and 50 mA cm-2, respectively, in hydrofluoric acid/ethanol (1:2 v/v). Spin coating and solvent casting methods were then utilized to modify the AAO, planar Si, and pSiRF sensors with the biodegradable polymer poly(lactic acid) (PLA). The modification of those sensors was investigated using FESEM, energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDX), thermogravimetric analysis (TGA), ellipsometry, contact angle, and reflectometric interference spectroscopy (RIfS) techniques. The enzymatic degradation of PLA in these sensors, catalyzed by proteinase K, a fungal enzyme, and proteases secreted by the pathogen Pseudomonas aeruginosa (PAO1) (P. aeruginosa) (PAO1), was studied. The water contact angle showed a change in the wettability after the enzymatic reaction, which is consistent with a reduction in the calculated carbonyl band observed in Fourier transform infrared (FTIR) spectra. Atomic force microscopy (AFM) roughness data also confirmed the PLA film degradation. RIfS emphasized the occurrence of the degradation of PLA-modified pores of AAO and pSiRF. The data showed a decrease in effective optical thickness (EOT) and a blue-shift in wavelength after treatment with proteinase K. Finally, the AAO and pSiRF sensors were tested in the P. aeruginosa (PAO1) cultures and their corresponding sterile-filtered culture supernatants. The results revealed that the enzymatic reaction of PLA was detectable compared to the free enzyme solution (LB medium). Interestingly, there were noticeable color shifts in the pSiRF sensor, transitioning from green to blue, when exposed to pure proteinase K solution or P. aeruginosa (PAO1) cultures. This color change could be detected by the bare eye after treating the sensor with the enzyme, washing, and drying, suggesting that this principle may be improved and potentially utilized to sense bacterial enzymes of clinically relevant bacterial pathogens visually and rapidly.