Investigating the Crosstalk between Small Extracellular vesicles and RNA granules in Huntington’s Disease

Abstract

Huntington’s disease (HD) is a neurodegenerative disorder marked by progressive neuronal degeneration, with no current cure. Recent research suggests that RNA granules (such as stress granules and p-bodies) and small extracellular vesicles (sEVs) play critical roles in cellular dysfunction in HD. Both compartments share features like liquid-liquid phase separation (LLPS) and RNA-binding proteins, but the relationship between mutant huntingtin (mHTT) and their shared content remains unexplored. In this study, we analyze the transcriptomic and proteomic profiles of sEVs and RNA granules in a model expressing mHTT to understand their molecular interactions in HD. Our results show significant changes in gene expression in both sEVs and RNA granules, with a notable decrease in sEVs. Long non-coding RNAs (lncRNAs) were abundant in both compartments, and their expression shifted in HD, suggesting their involvement in disease progression. Additionally, 139 genes in our marker list are regulated by the Repressor Element 1 Silencing Transcription Factor (REST), which is disrupted in HD. Three marker genes (SNHG7, LHR1 LNC1610-1, and lnc-DUXA-1) were validated in RNA granules using RNA-FISH, showing partial co-localization with YB1-positive stress granules. qRT-PCR confirmed increased expression of all five marker genes (lnc-SLC30A5-6, SNHG7, SNHG12, LHR1-LNC1610-1, and lnc-DUXA-1) in HD RNA granules, with three markers showing increased expression in sEVs, though two exhibited high variability. To validate the relevance of our findings, we compared the expression patterns of HD sEV marker genes with a recently published RNA sequencing dataset of plasma EVs from HD patients. Our results show a stronger correlation between the pre-HD group in the patient dataset and our cell model, suggesting that our model better reflects the early stages of HD progression. We also identified distinct protein profiles in HD sEVs and RNA granules, with 13 shared proteins, highlighting a unique molecular signature for HD. STRING and KEGG pathway analyses revealed enriched pathways related to neurodegenerative diseases, suggesting broader impacts on neurodegenerative processes. Overlapping GO terms between RNA granules and sEVs point to functional interactions, particularly in RNA transport and metabolism. Notably, WDR1, a protein associated with mHTT-RNA complexes, was identified in both HD sEVs and RNA granules, suggesting its role in HD pathogenesis by influencing RNA granule formation and facilitating intercellular communication via sEVs. Our findings demonstrate that mHTT alters the composition of sEVs and RNA granules in HD. The detection of miRNAs, zinc finger proteins (ZNFs), and lncRNAs in sEVs suggests that HD cells may attempt to manage stress and intercellular signaling. The identification of overlapping proteins like WDR1, RANBP6, and ITGAV offers potential biomarkers and therapeutic targets. This study enhances our understanding of HD pathology by revealing the differential sorting of RNA and proteins in HD, with implications for early diagnosis and targeted therapies.

Die Huntington-Krankheit (HD) ist eine neurodegenerative Erkrankung, die durch progressive neuronale Degeneration charakterisiert ist und für die es derzeit keine Therapie gibt. Aktuelle Forschungsergebnisse deuten darauf hin, dass RNA-Granula (wie Stress-Granula und P-Bodies) und kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs) eine entscheidende Rolle bei der zellulären Dysfunktion bei HD spielen. Beide Kompartimente teilen Merkmale wie ihre Verbindung zum Prozess der liquid-liquid phase separation (LLPS) und in beiden Kompartimenten vorkommende RNA-bindende Proteine. Die Beziehung zwischen mutiertem Huntingtin (mHTT) und ihrem gemeinsamen Inhalt ist bislang jedoch nicht vollständig erforscht. In der vorliegenden Arbeit wurden die transkriptomischen und proteomischen Profile von sEVs und RNA-Granula in einem Modell, das mHTT exprimiert, untersucht um ihre molekularen Interaktionen bei HD zu verstehen. Unsere Ergebnisse zeigen signifikante Veränderungen in der Genexpression sowohl in sEVs als auch in RNA-Granula. Long non coding RNAs (lncRNAs) waren in beiden Kompartimenten reichlich vorhanden, und ihre Expression verschob sich bei HD, was auf ihre Beteiligung an der Krankheitsprogression schließen lässt. Die Analyse der differentiellen Genexpression, insbesondere der lncRNAs, stimmt mit den RNA-Sequenzierungsdaten aus den EVs von HD-Patientenplasma überein. Darüber hinaus werden 139 Gene in unserer Markerliste durch den Repressor Element 1 Silencing Transcription Factor (REST) reguliert, der bei HD unterbrochen ist. Drei Markergene (SNHG7, lnc-LHR1 und lnc-DUXA-1) wurden mittels RNA-FISH in RNA-Granula validiert und zeigten eine teilweise Ko-Lokalisierung mit YB1-positiven Stress-Granula. Die qRT-PCR bestätigte eine erhöhte Expression aller fünf Markergene (lnc-SLC30A5-6, SNHG7, SNHG12, lnc-LHR1, and lnc-DUXA-1) in HD-RNA-Granula. Dieser Marker zeigten auch in sEVs eine erhöhte Expression während die anderen zwei Variabilität zeigten. Um die Relevanz unserer Ergebnisse zu überprüfen, haben wir die Expressionsmuster von HD sEV-Markergenen mit einem kürzlich veröffentlichten RNA-Sequenzierungsdatensatz von Plasma-EVs von HD-Patienten verglichen. Unsere Ergebnisse zeigen eine stärkere Korrelation zwischen der Prä-HD-Gruppe und unserem Zellmodell, was darauf hindeutet, dass unser Modell die frühen Stadien der HD-Progression besser wiedergibt. Wir haben auch unterschiedliche Proteinprofile in HD sEVs und RNA-Granula identifiziert, mit 13 gemeinsamen Proteinen, was eine einzigartige molekulare Signatur für HD hervorhebt. STRING- und KEGG-analysen ergaben eine Anreicherung von Signalwegen, die mit neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung stehen. Sich überschneidende GO-Terme zwischen RNA-Granula und sEVs deuten auf funktionelle Interaktionen hin, insbesondere beim RNA-Transport und -Stoffwechsel. Insbesondere WDR1, ein Protein, das mit mHTT-RNA Komplexen assoziiert ist, wurde sowohl in HD sEVs als auch in RNA-Granula identifiziert, was auf seine Rolle in der HD-Pathogenese hinweist, indem es die Bildung von RNA-Granula beeinflusst und die interzelluläre Kommunikation über sEVs erleichtert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass mHTT die Zusammensetzung von sEVs und RNA-Granula bei HD verändert. Der Nachweis von miRNAs, Zinkfingerproteinen (ZNFs) und lncRNAs in sEVs deutet darauf hin, dass HD-Zellen versuchen könnten, Stress und interzelluläre Signalwege verändert zu regulieren. Die Identifizierung von sich überlappenden Proteinen wie WDR1, RANBP6 und ITGAV zeigt potenzielle Biomarker und therapeutische Ziele auf. Diese Studie erweitert unser Verständnis der HD-Pathologie, indem sie die unterschiedliche Sortierung von RNA und Proteinen bei HD aufklärt, was für die Frühdiagnose und gezielte Therapien nützlich sein kann.